Rompere la barriera orale（3）

La scoperta, l'ottimizzazione e la successiva modifica di PN-235 (icotrokinra, JN-2113)

I vantaggi dei peptidi ciclici somministrati per via orale sono stati dettagliati in articoli precedenti, con il PN-235 che ha ricevuto un'attenzione significativa come uno dei pochissimi farmaci peptidici ciclici attualmente disponibili per la somministrazione orale. Il 21 luglio 2025, Protagonist e Janssen hanno annunciato di aver presentato alla FDA una nuova domanda di farmaco (NDA) per Icotrokinra, per il trattamento della psoriasi a placche da moderata a grave negli adulti e nei bambini di età pari o superiore a 12 anni. Se approvato, Icotrokinra dovrebbe diventare il primo farmaco orale al mondo mirato all’IL-23R per il trattamento della psoriasi. Questo articolo si concentra sul processo di scoperta e sulle strategie di ottimizzazione sistematica di questa molecola, utilizzando le date di pubblicazione dei brevetti come sequenza temporale, e riassume anche le potenziali direzioni per un'ulteriore ottimizzazione.

Già nel 2007, Valorisation Hsj, Societe En Commandite ha depositato una domanda di brevetto per gli antagonisti del peptide IL-23R (WO2009007849). Questo è uno dei primi brevetti che coinvolgono gli antagonisti del peptide IL-23R nelle informazioni disponibili al pubblico. Questo brevetto descrive una serie di peptidi mirati all'IL-23R, incluso l'agonista APG-2301 e gli antagonisti APG-2303, APG-2305, APG-2307 e APG-2309 (sequenze mostrate nella figura seguente). Il team ha utilizzato la sequenza aminoacidica dell’IL-23R come base, combinata con tecniche di modellazione computerizzata, per generare peptidi lineari corrispondenti alla sua regione cerniera (imitando l’IL-23 e agendo come antagonisti dell’IL-23R). Tra questi, APG-2305 e APG-2309 hanno inibito efficacemente la fosforilazione di STAT3 negli splenociti di topo in vitro, con valori IC50 di 1 nM e 2 nM, rispettivamente. Inoltre, in un modello di IBD di ratto, il trattamento con APG-2309 ha alleviato significativamente l’edema e il rossore indotti dall’infiammazione e ha ridotto significativamente l’infiltrazione leucocitaria della mucosa e la congestione vascolare, dimostrando un buon potenziale antinfiammatorio e terapeutico.

Nel 2013, i Medical Diagnostic Laboratories (MDL) hanno pubblicato un brevetto (US20130029907) che descrive la scoperta di peptidi che legano IL-23R-utilizzando la tecnologia phage display, identificando con successo diverse sequenze peptidiche che si legano specificamente a IL-23R. Questa ricerca ha costruito una libreria di visualizzazione dei fagi M13 contenente sequenze peptidiche casuali di 12-meri e ha eseguito più cicli di screening utilizzando IL-23R ricombinante solubile a lunghezza intera e le sue varianti di giunzione come target. Alla fine sono stati identificati 27 peptidi con attività legante. In particolare, queste sequenze peptidiche hanno mostrato una bassa somiglianza con la struttura cristallina dell'IL-23 riportata da Beyer et al. (ID PDB: 3D85). Attraverso l'allineamento delle sequenze, i ricercatori hanno scoperto che il 66,7% dei peptidi conteneva una sequenza di riconoscimento conservata: -WX1X2X3W-, che si ipotizzava fosse un motivo funzionale chiave per legarsi all'IL-23R e bloccarne la trasduzione del segnale a valle (una sequenza rappresentativa è mostrata nella figura seguente). Successivamente, i ricercatori hanno valutato l'attività inibitoria dei peptidi sul legame dell'IL-23 con l'IL-23R utilizzando esperimenti ELISA competitivi, identificando il peptide 23 (un peptide di 12-meri) come il peptide più attivo, che ha inibito significativamente il legame dell'IL-23 con l'IL-23R (IC50=0.85 µM).

Sulla base di ciò, il team ha ottimizzato la struttura del peptide 23, compreso l'estensione o l'accorciamento dei terminali C/N, la sostituzione degli amminoacidi interni con amminoacidi acidi/neutri/basici e le modifiche della ciclizzazione. Risultati ELISA competitivi hanno mostrato che l’estensione degli amminoacidi su entrambe le estremità del peptide 23 ha avuto scarso effetto sulla sua attività inibitoria, ma l’accorciamento ha portato ad una diminuzione dell’attività inibitoria. La modifica delle proprietà di carica dei residui "X" nel motivo centrale -WX1X2X3W- (ad esempio, la sostituzione dei residui caricati negativamente con altri residui caricati negativamente, polari privi di carica o caricati positivamente) non ha influenzato in modo significativo la sua attività inibitoria, indicando che le caratteristiche di carica dei residui in questa regione non sono determinanti chiave dell'attività legante. La sostituzione di uno dei residui di triptofano (W) nella struttura centrale con fenilalanina (F) o tirosina (Y) ha mantenuto la sua capacità inibitoria, mentre la sua sostituzione con alanina (A) ha ridotto l'attività, il che è coerente con le caratteristiche della sequenza ottenute dal precedente screening del phage display.

Inoltre, accorciando il peptide 23.15 mantenendo la struttura centrale -WQDYW-, sebbene il motivo centrale fosse preservato, ha indebolito significativamente la sua attività inibitoria. Inoltre, l'introduzione di cisteina (Cys) su entrambe le estremità per formare un peptide ciclico ha prodotto un'attività paragonabile al peptide lineare; tuttavia, la riduzione delle dimensioni del peptide ciclico a 7 o 9 peptidi mantenendo la struttura centrale ha indebolito significativamente la sua capacità di inibire IL-23R.

In due successivi brevetti pubblicati da MDL (US20130172272 e US20160039878), i ricercatori hanno utilizzato la struttura centrale -WX1X2X3W- come impalcatura e hanno costruito e selezionato una libreria di peptidi mirata utilizzando la tecnologia di visualizzazione dei ribosomi (sequenza della libreria di peptidi: XXXWXXYWXXXX). Dopo otto cicli di screening, i peptidi sono stati ulteriormente suddivisi in base alla struttura -WX1X2YW-: il gruppo A conteneva -WVDYW-, il gruppo B conteneva -WQDYW- e il gruppo C conteneva peptidi con altre sequenze core. I test di attività ELISA hanno dimostrato che il Peptide No. 2/7 nel Gruppo A aveva un'attività superiore rispetto al Peptide No. 23.19 divulgato nel brevetto precedente. Nei test ELISA competitivi, il Peptide No. 7 aveva un IC50 di 58,0 nM e il Peptide No. 2 aveva un IC50 di 34,6 nM.

Successivamente, utilizzando il Peptide NO.2 e il Peptide NO.7 come punto di partenza, sono stati progettati e sintetizzati tre peptidi ciclici: 2HT-AA, 7-CC e 7HT-AA. Tra questi, la molecola 2HT-AA, basata sulla ciclizzazione dalla testa-alla-coda dei residui di alanina su entrambe le estremità del peptide NO.2, ha mostrato l'attività migliore (struttura mostrata nella figura seguente), con un ELISA IC50 competitivo di 8,1 nM e un'attività reporter di 341,8 nM (metodo di test: IL-23 ha stimolato una linea cellulare DB trasfettato con un gene reporter STAT3 e l'attività inibitoria è stata quantificata rilevando l'espressione del gene reporter). Ciò ha rappresentato un aumento dell'attività di 4-6 volte rispetto al peptide lineare. Nei test di attività in vitro, 2HT-AA ha inibito efficacemente la secrezione di IL-17F indotta da IL-23 nelle cellule Th17 umane in modo concentrazione-dipendente e ha bloccato la produzione di IL-22 nelle PBMC umane e negli splenociti di ratto. Allo stesso tempo, questo peptide ciclico ha anche sottoregolato i livelli di mRNA di IL-17F negli splenociti di ratto. Sfortunatamente, nonostante la promettente attività farmacologica del 2HT-AA, non sono stati trovati successivi rapporti di ottimizzazione di questa struttura peptidica ciclica e dei suoi derivati ​​da parte di MDL.